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組織芯片制備

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熒光免疫組化操作步驟

2020-10-30

熒光免疫組化操作步驟

免疫組化(SP法)操作步驟

1. 切片常規脫蠟至水。如需抗原修復,可在此步后進行

2.緩沖液洗 3min/2 次。

3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色,將切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分鐘。

4. 緩沖液洗 5min/2 次。

5. 滴加 Ultra V Block , 在室溫下孵育 5 分鐘以封閉非特異性的背景染色。

(注:孵育不要超過 10 分鐘,否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有 5 - 10% 正常羊血清,這一步可以省略。)

6. 緩沖液洗 5min/2 次。

7. 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 - 2 小時。(具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定)

8. 緩沖液洗 5min/2 次。

9 . 滴加 Primary Antibody Enhancer(增強子),在室溫下孵育 20 分鐘。

10 .緩沖液洗 5min/2 次。

11 .滴加 HRP Polymer(酶標二抗) ,在室溫下孵育 30 分鐘。

(注:HRP Polymer 對光敏感,應避免不必要的光暴露并儲存在不透明的小瓶中。)

12 .緩沖液洗 5min/2 次。

13 .向 1ml DAB Plus Substrate (或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen (或 AEC Plus Chromogen),混勻后滴加到切片上,孵育 3 - 15 分鐘。(具體時間由染色深淺決定。)

14 .自來水充分沖洗,復染,脫水,透明,封片。


操作步驟

⑴、石蠟切片脫蠟至水。

⑵、 3%H 2 O2 室溫孵育 5-10 分鐘,以消除內源性過氧化物酶的活性。

⑶、蒸餾水沖洗, PBS 浸泡 5 分鐘 x2 (如需抗原修復,可在此步后進行)。

⑷、 5-10% 正常山羊血清(PBS 稀釋)封閉,室溫孵育 10 分鐘,傾去血清,勿洗。滴加 一抗 工作液, 37 ℃ 孵育 1-2 小時或 4 ℃ 過夜。

⑸、 PBS 沖洗, 5 分鐘 x3 次。

⑹、滴加適量 生物素標記二抗 工作液, 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。

⑺、 PBS 沖洗, 5 分鐘 x3 次。

⑻、滴加適量的 辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素 工作液, 37 ℃ 孵育 10-30 分鐘。

⑼、 PBS 沖洗, 5 分鐘 x3 次。

⑽、顯色劑顯色 3-15 分鐘(DAB 或 NBT/BCIP)

⑾、自來水充分沖洗,復染,脫水,透明,封片。

化染色步驟

冰凍切片 4-8μm ,室溫放置 30 分鐘后,入 4 ℃丙酮固定 10分鐘,PBS洗,5分鐘x3,用過氧化氫孵育5-10分鐘,消除內源性過氧化物酶的活性。


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